Terima kasih kerana melayari nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan menggunakan versi pelayar terkini (atau melumpuhkan mod keserasian dalam Internet Explorer). Di samping itu, untuk memastikan sokongan berterusan, laman web ini akan bebas daripada gaya dan JavaScript.
Otot rangka ialah tisu heterogen yang kebanyakannya terdiri daripada miofibril, yang pada manusia biasanya dikelaskan kepada tiga jenis: satu "perlahan" (jenis 1) dan dua "pantas" (jenis 2A dan 2X). Walau bagaimanapun, heterogeniti antara dan dalam jenis miofibril tradisional masih kurang difahami. Kami menggunakan pendekatan transkriptomik dan proteomik kepada 1050 dan 1038 miofibril individu daripada vastus lateralis manusia. Kajian proteomik melibatkan lelaki, dan kajian transkriptomik melibatkan 10 lelaki dan 2 wanita. Selain isoform rantai berat miosin, kami mengenal pasti protein metabolik, protein ribosom, dan protein junctional selular sebagai sumber kebolehubahan intermiofibril berbilang dimensi. Tambahan pula, walaupun telah mengenal pasti kelompok gentian perlahan dan pantas, data kami menunjukkan bahawa gentian jenis 2X secara fenotip tidak dapat dibezakan daripada gentian berkedut pantas yang lain. Tambahan pula, pengelasan berasaskan rantai berat miosin tidak mencukupi untuk menggambarkan fenotip miofibril dalam miopati nemalin. Secara keseluruhan, data kami mencadangkan heterogeniti miofiber multidimensi, dengan sumber variasi melangkaui isoform rantai berat miosin.
Heterogeniti selular merupakan ciri yang wujud dalam semua sistem biologi, yang membolehkan sel mengkhusus untuk memenuhi keperluan tisu dan sel yang berbeza.1 Pandangan tradisional tentang heterogeniti gentian otot rangka ialah neuron motor menentukan jenis gentian dalam unit motor, dan jenis gentian (iaitu, jenis 1, jenis 2A, dan jenis 2X pada manusia) ditentukan oleh ciri-ciri isoform rantai berat miosin (MYH).2 Ini pada mulanya berdasarkan ketidakstabilan pH ATPase mereka,3,4 dan kemudian pada ekspresi molekul MYH mereka.5 Walau bagaimanapun, dengan pengenalpastian dan penerimaan gentian "campuran" yang mengekspresikan bersama pelbagai MYH dalam perkadaran yang berbeza-beza, gentian otot rangka semakin dilihat sebagai kontinum dan bukannya sebagai jenis gentian yang berbeza.6 Walaupun begitu, bidang ini masih banyak bergantung pada MYH sebagai pengelas utama untuk pengelasan miofiber, pandangan yang mungkin dipengaruhi oleh batasan dan bias yang ketara dalam kajian tikus awal yang profil ekspresi MYH dan julat jenis gentiannya berbeza daripada yang terdapat pada manusia.2 Keadaan ini menjadi lebih rumit oleh fakta bahawa otot rangka manusia yang berbeza mempamerkan pelbagai jenis gentian.7 Vastus lateralis ialah otot campuran dengan profil ekspresi MYH pertengahan (dan oleh itu mewakili).7 Tambahan pula, kemudahan pensampelannya menjadikannya otot yang paling banyak dikaji pada manusia.
Oleh itu, penyiasatan yang tidak berat sebelah terhadap kepelbagaian gentian otot rangka menggunakan alat "omics" yang berkuasa adalah kritikal tetapi juga mencabar, sebahagiannya disebabkan oleh sifat multinukleus gentian otot rangka. Walau bagaimanapun, teknologi transkriptomik8,9 dan proteomik10 telah mengalami revolusi dalam kepekaan dalam beberapa tahun kebelakangan ini disebabkan oleh pelbagai kemajuan teknologi, yang membolehkan analisis otot rangka pada resolusi gentian tunggal. Hasilnya, kemajuan yang ketara telah dicapai dalam mencirikan kepelbagaian gentian tunggal dan tindak balasnya terhadap rangsangan atrofik dan penuaan11,12,13,14,15,16,17,18. Yang penting, kemajuan teknologi ini mempunyai aplikasi klinikal, yang membolehkan pencirian disregulasi berkaitan penyakit yang lebih terperinci dan tepat. Contohnya, patofisiologi miopati nemalin, salah satu penyakit otot yang diwarisi yang paling biasa (MIM 605355 dan MIM 161800), adalah kompleks dan mengelirukan.19,20 Oleh itu, pencirian disregulasi gentian otot rangka yang lebih baik boleh membawa kepada kemajuan yang ketara dalam pemahaman kita tentang penyakit ini.
Kami membangunkan kaedah untuk analisis transkriptomik dan proteomik gentian otot rangka tunggal yang diasingkan secara manual daripada spesimen biopsi manusia dan mengaplikasikannya pada beribu-ribu gentian, membolehkan kami menyiasat heterogeniti selular gentian otot rangka manusia. Dalam kajian ini, kami menunjukkan kuasa fenotip transkriptomik dan proteomik gentian otot dan mengenal pasti protein junctional metabolik, ribosom dan selular sebagai sumber kebolehubahan antara gentian yang ketara. Tambahan pula, dengan menggunakan aliran kerja proteomik ini, kami mencirikan kaitan klinikal miopati nematod dalam gentian otot rangka tunggal, mendedahkan peralihan terselaras ke arah gentian bukan oksidatif yang bebas daripada jenis gentian berdasarkan MYH.
Untuk mengkaji heterogeniti gentian otot rangka manusia, kami membangunkan dua aliran kerja untuk membolehkan analisis transkriptom dan proteom gentian otot rangka tunggal (Rajah 1A dan Rajah Tambahan 1A). Kami membangunkan dan mengoptimumkan beberapa langkah metodologi, daripada penyimpanan sampel dan pemeliharaan integriti RNA dan protein kepada pengoptimuman daya pemprosesan untuk setiap pendekatan. Untuk analisis transkriptom, ini dicapai dengan memasukkan kod bar molekul khusus sampel pada langkah awal transkripsi terbalik, yang membolehkan 96 gentian dikumpulkan untuk pemprosesan hiliran yang cekap. Penjujukan yang lebih dalam (±1 juta bacaan setiap gentian) berbanding pendekatan sel tunggal tradisional memperkayakan lagi data transkriptom. 21 Untuk proteomik, kami menggunakan kecerunan kromatografi pendek (21 minit) yang digabungkan dengan pemerolehan data DIA-PASEF pada spektrometer jisim timsTOF untuk mengoptimumkan kedalaman proteom sambil mengekalkan daya pemprosesan yang tinggi. 22,23 Untuk mengkaji heterogeniti gentian otot rangka yang sihat, kami mencirikan transkriptom bagi 1,050 gentian individu daripada 14 penderma dewasa yang sihat dan proteom bagi 1,038 gentian daripada 5 penderma dewasa yang sihat (Jadual Tambahan 1). Dalam kertas kerja ini, set data ini masing-masing dirujuk sebagai transkriptom dan proteom 1,000 gentian. Pendekatan kami mengesan sejumlah 27,237 transkrip dan 2,983 protein dalam analisis transkriptom dan proteomik 1,000 gentian (Rajah 1A, Set Data Tambahan 1–2). Selepas menapis set data transkriptom dan proteomik untuk >1,000 gen yang dikesan dan 50% nilai sah setiap gentian, analisis bioinformatik berikutnya telah dilakukan untuk 925 dan 974 gentian dalam transkriptom dan proteom, masing-masing. Selepas penapisan, purata 4257 ± 1557 gen dan 2015 ± 234 protein (min ± SD) dikesan setiap gentian, dengan kebolehubahan antara individu yang terhad (Rajah Tambahan 1B–C, Set Data Tambahan 3–4). Walau bagaimanapun, kebolehubahan dalam subjek adalah lebih ketara merentasi peserta, mungkin disebabkan oleh perbezaan dalam hasil RNA/protein antara gentian yang mempunyai panjang dan luas keratan rentas yang berbeza. Bagi kebanyakan protein (>2000), pekali variasi adalah di bawah 20% (Rajah Tambahan 1D). Kedua-dua kaedah membolehkan penangkapan julat dinamik transkrip dan protein yang luas dengan tandatangan yang sangat jelas yang penting untuk pengecutan otot (cth., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Rajah Tambahan 1E–F). Kebanyakan ciri yang dikenal pasti adalah sama antara set data transkriptomik dan proteomik (Rajah Tambahan 1G), dan min keamatan UMI/LFQ ciri-ciri ini berkorelasi dengan agak baik (r = 0.52) (Rajah Tambahan 1H).
Aliran kerja transkriptomik dan proteomik (dicipta dengan BioRender.com). BD Lengkung julat dinamik untuk MYH7, MYH2 dan MYH1, dan ambang yang dikira untuk penetapan jenis gentian. E, F Taburan ekspresi MYH merentasi gentian dalam set data transkriptomik dan proteomik. G, H Plot Penghampiran dan Unjuran Kepelbagaian Seragam (UMAP) untuk transkriptomik dan proteomik yang diwarnakan oleh jenis gentian berasaskan MYH. I, J Plot ciri yang menunjukkan ekspresi MYH7, MYH2 dan MYH1 dalam set data transkriptomik dan proteomik.
Pada mulanya, kami berhasrat untuk menetapkan jenis gentian berasaskan MYH kepada setiap gentian menggunakan pendekatan yang dioptimumkan yang memanfaatkan kepekaan tinggi dan julat dinamik ekspresi MYH dalam set data omics. Kajian terdahulu telah menggunakan ambang sewenang-wenangnya untuk melabel gentian sebagai jenis tulen 1, jenis 2A, jenis 2X atau campuran berdasarkan peratusan tetap ekspresi MYH yang berbeza11,14,24. Kami menggunakan pendekatan yang berbeza di mana ekspresi setiap gentian disenaraikan oleh MYH yang kami gunakan untuk menaip gentian: MYH7, MYH2 dan MYH1, masing-masing sepadan dengan gentian jenis 1, jenis 2A dan jenis 2X. Kemudian, kami mengira secara matematik titik infleksi bawah setiap lengkung yang terhasil dan menggunakannya sebagai ambang untuk menetapkan gentian sebagai positif (di atas ambang) atau negatif (di bawah ambang) untuk setiap MYH (Rajah 1B–D). Data ini menunjukkan bahawa MYH7 (Rajah 1B) dan MYH2 (Rajah 1C) mempunyai profil ekspresi hidup/mati yang lebih jelas pada tahap RNA berbanding tahap protein. Sesungguhnya, pada peringkat protein, sangat sedikit gentian yang tidak mengekspresikan MYH7, dan tiada gentian yang mempunyai ekspresi MYH2 100%. Seterusnya, kami menggunakan ambang ekspresi yang telah ditentukan untuk menetapkan jenis gentian berasaskan MYH kepada semua gentian dalam setiap set data. Contohnya, gentian MYH7+/MYH2-/MYH1- telah diberikan kepada jenis 1, manakala gentian MYH7-/MYH2+/MYH1+ telah diberikan kepada jenis campuran 2A/2X (lihat Jadual Tambahan 2 untuk penerangan penuh). Dengan menggabungkan semua gentian, kami memerhatikan taburan jenis gentian berasaskan MYH yang sangat serupa pada kedua-dua peringkat RNA (Rajah 1E) dan protein (Rajah 1F), manakala komposisi relatif jenis gentian berasaskan MYH berbeza-beza mengikut individu, seperti yang dijangkakan (Rajah Tambahan 2A). Kebanyakan gentian dikelaskan sebagai sama ada jenis 1 tulen (34–35%) atau jenis 2A (36–38%), walaupun sebilangan besar gentian jenis campuran 2A/2X juga dikesan (16–19%). Perbezaan yang ketara ialah gentian jenis 2X tulen hanya boleh dikesan pada tahap RNA, tetapi bukan pada tahap protein, menunjukkan bahawa ekspresi MYH yang pesat sekurang-kurangnya sebahagiannya dikawal selia secara pasca transkripsi.
Kami mengesahkan kaedah menaip gentian MYH berasaskan proteomik kami menggunakan dot blotting berasaskan antibodi, dan kedua-dua kaedah mencapai persetujuan 100% dalam mengenal pasti gentian jenis 1 dan jenis 2A tulen (lihat Rajah Tambahan 2B). Walau bagaimanapun, pendekatan berasaskan proteomik adalah lebih sensitif, lebih cekap dalam mengenal pasti gentian campuran, dan mengukur perkadaran setiap gen MYH dalam setiap gentian. Data ini menunjukkan keberkesanan penggunaan pendekatan berasaskan omics yang objektif dan sangat sensitif untuk mencirikan jenis gentian otot rangka.
Kemudian, kami menggunakan maklumat gabungan yang disediakan oleh transkriptomik dan proteomik untuk mengklasifikasikan miofiber secara objektif berdasarkan transkriptom atau proteom lengkapnya. Menggunakan kaedah penghampiran dan unjuran manifold seragam (UMAP) untuk mengurangkan dimensi kepada enam komponen utama (Rajah Tambahan 3A–B), kami dapat menggambarkan kebolehubahan miofiber dalam transkriptom (Rajah 1G) dan proteom (Rajah 1H). Terutamanya, miofiber tidak dikumpulkan mengikut peserta (Rajah Tambahan 3C–D) atau hari ujian (Rajah Tambahan 3E) sama ada dalam set data transkriptomik atau proteomik, menunjukkan bahawa kebolehubahan dalam subjek dalam gentian otot rangka adalah lebih tinggi daripada kebolehubahan antara subjek. Dalam plot UMAP, dua kelompok berbeza yang mewakili miofiber "pantas" dan "perlahan" muncul (Rajah 1G–H). Miofiber MYH7+ (perlahan) dikelompokkan di kutub positif UMAP1, manakala miofiber MYH2+ dan MYH1+ (pantas) dikelompokkan di kutub negatif UMAP1 (Rajah 1I–J). Walau bagaimanapun, tiada perbezaan dibuat antara jenis gentian berkedut pantas (iaitu, jenis 2A, jenis 2X, atau campuran 2A/2X) berdasarkan ekspresi MYH, menunjukkan bahawa MYH1 (Rajah 1I–J) atau penanda miofiber 2X klasik lain seperti ekspresi ACTN3 atau MYLK2 (Rajah Tambahan 4A–B) tidak membezakan antara jenis miofiber yang berbeza apabila mempertimbangkan keseluruhan transkriptom atau proteom. Selain itu, berbanding dengan MYH2 dan MYH7, hanya sedikit transkrip atau protein yang berkorelasi positif dengan MYH1 (Rajah Tambahan 4C–H), menunjukkan bahawa kelimpahan MYH1 tidak mencerminkan sepenuhnya transkriptom/proteom miofiber. Kesimpulan yang serupa dicapai ketika menilai ekspresi campuran tiga isoform MYH pada tahap UMAP (Rajah Tambahan 4I–J). Oleh itu, walaupun gentian 2X dapat dikenal pasti pada tahap transkrip berdasarkan kuantifikasi MYH sahaja, gentian MYH1+ tidak dapat dibezakan daripada gentian pantas lain apabila mempertimbangkan keseluruhan transkriptom atau proteom.
Sebagai penerokaan awal heterogeniti gentian perlahan melangkaui MYH, kami menilai empat protein khusus jenis gentian perlahan yang telah ditetapkan: TPM3, TNNT1, MYL3, dan ATP2A22. Subjenis gentian perlahan menunjukkan korelasi Pearson yang tinggi, walaupun tidak sempurna, dengan MYH7 dalam kedua-dua transkriptomik (Rajah Tambahan 5A) dan proteomik (Rajah Tambahan 5B). Kira-kira 25% dan 33% gentian perlahan tidak dikelaskan sebagai gentian perlahan tulen oleh semua subjenis gen/protein dalam transkriptomik (Rajah Tambahan 5C) dan proteomik (Rajah Tambahan 5D), masing-masing. Oleh itu, pengelasan gentian perlahan berdasarkan pelbagai subjenis gen/protein memperkenalkan kerumitan tambahan, walaupun untuk protein yang diketahui khusus jenis gentian. Ini menunjukkan bahawa pengelasan gentian berdasarkan isoform keluarga gen/protein tunggal mungkin tidak mencerminkan heterogeniti sebenar gentian otot rangka dengan secukupnya.
Untuk meneroka lebih lanjut kebolehubahan fenotip gentian otot rangka manusia pada skala keseluruhan model omics, kami melakukan pengurangan dimensi data yang tidak berat sebelah menggunakan analisis komponen utama (PCA) (Rajah 2A). Sama seperti plot UMAP, peserta mahupun hari ujian tidak mempengaruhi pengelompokan gentian pada peringkat PCA (Rajah Tambahan 6A–C). Dalam kedua-dua set data, jenis gentian berasaskan MYH dijelaskan oleh PC2, yang menunjukkan kelompok gentian jenis 1 berkedut perlahan dan kelompok kedua yang mengandungi gentian jenis 2A berkedut pantas, jenis 2X, dan gentian campuran 2A/2X (Rajah 2A). Dalam kedua-dua set data, kedua-dua kelompok ini dihubungkan oleh sebilangan kecil gentian jenis 1/2A campuran. Seperti yang dijangkakan, analisis perwakilan berlebihan pemacu PC utama mengesahkan bahawa PC2 didorong oleh tandatangan kontraktil dan metabolik (Rajah 2B dan Rajah Tambahan 6D–E, Set Data Tambahan 5–6). Secara keseluruhan, jenis gentian berasaskan MYH didapati mencukupi untuk menjelaskan variasi berterusan di sepanjang PC2, kecuali gentian 2X yang diedarkan di seluruh transkriptom dalam kluster pantas.
A. Plot analisis komponen utama (PCA) bagi set data transkriptom dan proteom yang diwarnakan mengikut jenis gentian berdasarkan MYH. B. Analisis pengayaan pemacu transkrip dan protein dalam PC2 dan PC1. Analisis statistik dilakukan menggunakan pakej clusterProfiler dan nilai-p yang diselaraskan oleh Benjamini-Hochberg. C, D. Plot PCA yang diwarnakan mengikut istilah ontologi gen lekatan antara sel (GO) dalam istilah transkriptom dan kostamer GO dalam proteom. Anak panah mewakili pemacu transkrip dan protein serta arahnya. E, F. Plot ciri penghampiran dan unjuran manifold seragam (UMAP) bagi ciri-ciri yang berkaitan secara klinikal yang menunjukkan kecerunan ekspresi bebas daripada jenis gentian perlahan/cepat. G, H. Korelasi antara pemacu PC2 dan PC1 dalam transkriptom dan proteom.
Tanpa diduga, jenis miofiber berasaskan MYH hanya menjelaskan tahap kebolehubahan kedua tertinggi (PC2), menunjukkan bahawa faktor biologi lain yang tidak berkaitan dengan jenis miofiber berasaskan MYH (PC1) memainkan peranan penting dalam mengawal selia heterogeniti gentian otot rangka. Analisis perwakilan berlebihan pemacu utama dalam PC1 mendedahkan bahawa kebolehubahan dalam PC1 terutamanya ditentukan oleh lekatan sel-sel dan kandungan ribosom dalam transkriptom, dan kostamer dan protein ribosom dalam proteom (Rajah 2B dan Rajah Tambahan 6D–E, Set Data Tambahan 7). Dalam otot rangka, kostamer menghubungkan cakera-Z ke sarkolema dan terlibat dalam penghantaran daya dan isyarat. 25 Plot PCA beranotasi menggunakan ciri lekatan sel-sel (transkriptom, Rajah 2C) dan kostamer (proteom, Rajah 2D) mendedahkan anjakan kiri yang kuat dalam PC1, menunjukkan bahawa ciri-ciri ini diperkaya dalam gentian tertentu.
Pemeriksaan yang lebih terperinci terhadap pengelompokan miofiber pada tahap UMAP mendedahkan bahawa kebanyakan ciri mempamerkan kecerunan ekspresi berasaskan MYH bebas jenis miofiber dan bukannya khusus subkelompok miofiber. Kesinambungan ini diperhatikan untuk beberapa gen yang berkaitan dengan keadaan patologi (Rajah 2E), seperti CHCHD10 (penyakit neuromuskular), SLIT3 (atrofi otot), CTDNEP1 (penyakit otot). Kesinambungan ini juga diperhatikan merentasi proteom, termasuk protein yang berkaitan dengan gangguan neurologi (UGDH), isyarat insulin (PHIP), dan transkripsi (HIST1H2AB) (Rajah 2F). Secara kolektif, data ini menunjukkan kesinambungan dalam heterogeniti sentakan perlahan/cepat bebas jenis gentian merentasi miofiber yang berbeza.
Menariknya, gen pemacu dalam PC2 menunjukkan korelasi transkriptom-proteom yang baik (r = 0.663) (Rajah 2G), menunjukkan bahawa jenis gentian berkedut perlahan dan cepat, dan khususnya sifat kontraktil dan metabolik gentian otot rangka, dikawal selia secara transkripsi. Walau bagaimanapun, gen pemacu dalam PC1 tidak menunjukkan korelasi transkriptom-proteom (r = -0.027) (Rajah 2H), menunjukkan bahawa variasi yang tidak berkaitan dengan jenis gentian berkedut perlahan/cepat sebahagian besarnya dikawal selia secara pasca-transkripsi. Oleh kerana variasi dalam PC1 terutamanya dijelaskan oleh istilah ontologi gen ribosom, dan memandangkan ribosom memainkan peranan penting dan khusus dalam sel dengan mengambil bahagian secara aktif dan mempengaruhi terjemahan protein,31 kami seterusnya memulakan kajian untuk mengkaji heterogeniti ribosom yang tidak dijangka ini.
Kami mula-mula mewarnakan plot analisis komponen utama proteomik mengikut kelimpahan relatif protein dalam istilah GOCC "ribosom sitoplasma" (Rajah 3A). Walaupun istilah ini diperkaya pada sisi positif PC1, menghasilkan kecerunan kecil, protein ribosom memacu pembahagian dalam kedua-dua arah PC1 (Rajah 3A). Protein ribosom yang diperkaya pada sisi negatif PC1 termasuk RPL18, RPS18, dan RPS13 (Rajah 3B), manakala RPL31, RPL35, dan RPL38 (Rajah 3C) adalah pemacu utama pada sisi positif PC1. Menariknya, RPL38 dan RPS13 diekspresikan dengan tinggi dalam otot rangka berbanding tisu lain (Rajah Tambahan 7A). Tandatangan ribosom tersendiri dalam PC1 ini tidak diperhatikan dalam transkriptom (Rajah Tambahan 7B), menunjukkan peraturan pasca-transkripsi.
A. Plot analisis komponen utama (PCA) diwarnakan mengikut istilah ontologi gen ribosom sitoplasma (GO) merentasi proteom. Anak panah menunjukkan arah variasi yang dimediasi protein dalam plot PCA. Panjang garis sepadan dengan skor komponen utama untuk protein tertentu. B, C. Plot ciri PCA untuk RPS13 dan RPL38. D. Analisis pengelompokan hierarki tanpa pengawasan bagi protein ribosom sitoplasma. E. Model struktur ribosom 80S (PDB: 4V6X) yang menonjolkan protein ribosom dengan kelimpahan yang berbeza dalam gentian otot rangka. F. Protein ribosom dengan stoikiometri berbeza yang disetempat berhampiran saluran keluar mRNA.
Konsep heterogeniti dan pengkhususan ribosom telah dicadangkan sebelum ini, di mana kehadiran subpopulasi ribosom yang berbeza (heterogeniti ribosom) boleh mempengaruhi terjemahan protein secara langsung dalam tisu dan sel yang berbeza32 melalui terjemahan terpilih bagi kumpulan transkrip mRNA tertentu34 (pengkhususan ribosom). Untuk mengenal pasti subpopulasi protein ribosom yang diekspresikan bersama dalam gentian otot rangka, kami melakukan analisis pengelompokan hierarki tanpa pengawasan bagi protein ribosom dalam proteom (Rajah 3D, Set Data Tambahan 8). Seperti yang dijangkakan, protein ribosom tidak berkelompok mengikut jenis gentian berdasarkan MYH. Walau bagaimanapun, kami mengenal pasti tiga kelompok protein ribosom yang berbeza; kelompok pertama (gugus_ribosomal_1) dikawal selia dengan RPL38 dan oleh itu mempunyai peningkatan ekspresi dalam gentian dengan profil PC1 positif. Kelompok kedua (gugus_ribosomal_2) dikawal selia dengan RPS13 dan dinaikkan dalam gentian dengan profil PC1 negatif. Kelompok ketiga (gugus_ribosomal_3) tidak menunjukkan ekspresi pembezaan yang terkoordinasi dalam gentian otot rangka dan boleh dianggap sebagai protein ribosom otot rangka "teras". Kedua-dua kelompok ribosom 1 dan 2 mengandungi protein ribosom yang sebelum ini telah ditunjukkan mengawal selia terjemahan alternatif (contohnya, RPL10A, RPL38, RPS19, dan RPS25) dan mempengaruhi perkembangan secara fungsional (contohnya, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Selaras dengan keputusan PCA, perwakilan heterogen protein ribosom yang diperhatikan merentasi gentian juga menunjukkan kesinambungan (Rajah Tambahan 7C).
Untuk menggambarkan lokasi protein ribosom heterogen dalam ribosom, kami menggunakan model struktur ribosom 80S manusia (Bank Data Protein: 4V6X) (Rajah 3E). Selepas mengasingkan protein ribosom yang tergolong dalam kelompok ribosom yang berbeza, lokasinya tidak sejajar rapat, menunjukkan bahawa pendekatan kami gagal memberikan pengayaan untuk kawasan/pecahan ribosom tertentu. Walau bagaimanapun, menariknya, perkadaran protein subunit besar dalam kelompok 2 adalah lebih rendah daripada dalam kelompok 1 dan 3 (Rajah Tambahan 7D). Kami memerhatikan bahawa protein dengan stoikiometri yang diubah dalam gentian otot rangka kebanyakannya terletak pada permukaan ribosom (Rajah 3E), selaras dengan keupayaannya untuk berinteraksi dengan unsur tapak kemasukan ribosom dalaman (IRES) dalam populasi mRNA yang berbeza, sekali gus menyelaraskan terjemahan terpilih. 40, 41 Tambahan pula, banyak protein dengan stoikiometri yang diubah dalam gentian otot rangka terletak berhampiran kawasan berfungsi seperti terowong keluar mRNA (Rajah 3F), yang secara selektif mengawal pemanjangan translasi dan penangkapan peptida tertentu. 42 Secara ringkasnya, data kami menunjukkan bahawa stoikiometri protein ribosom otot rangka mempamerkan heterogeniti, mengakibatkan perbezaan antara gentian otot rangka.
Seterusnya, kami berusaha untuk mengenal pasti tandatangan gentian berkedut pantas dan perlahan serta meneroka mekanisme pengawalaturan transkripsi mereka. Membandingkan kluster gentian berkedut pantas dan perlahan yang ditakrifkan oleh UMAP dalam dua set data (Rajah 1G–H dan 4A–B), analisis transkriptomik dan proteomik mengenal pasti 1366 dan 804 ciri yang berbeza secara berlimpah (Rajah 4A–B, Set Data Tambahan 9–12). Kami memerhatikan perbezaan yang dijangkakan dalam tandatangan yang berkaitan dengan sarkomer (contohnya, tropomiosin dan troponin), gandingan pengujaan-pengecutan (isoform SERCA), dan metabolisme tenaga (contohnya, ALDOA dan CKB). Selain itu, transkrip dan protein yang mengawal selia ubiquitination protein diekspresikan secara berbeza dalam gentian berkedut pantas dan perlahan (contohnya, USP54, SH3RF2, USP28, dan USP48) (Rajah 4A–B). Tambahan pula, gen protein mikrob RP11-451G4.2 (DWORF), yang sebelum ini telah ditunjukkan diekspresikan secara berbeza merentasi jenis gentian otot kambing43 dan meningkatkan aktiviti SERCA dalam otot jantung44, telah meningkat dengan ketara dalam gentian otot rangka perlahan (Rajah 4A). Begitu juga, pada tahap gentian individu, perbezaan ketara diperhatikan dalam tandatangan yang diketahui seperti isoform laktat dehidrogenase berkaitan metabolisme (LDHA dan LDHB, Rajah 4C dan Rajah Tambahan 8A)45,46 serta tandatangan khusus jenis gentian yang sebelum ini tidak diketahui (seperti IRX3, USP54, USP28, dan DPYSL3) (Rajah 4C). Terdapat pertindihan ketara ciri-ciri yang diekspresikan secara berbeza antara set data transkriptomik dan proteomik (Rajah Tambahan 8B), serta korelasi perubahan lipatan yang didorong terutamanya oleh ekspresi perbezaan ciri sarkomer yang lebih ketara (Rajah Tambahan 8C). Terutamanya, beberapa tandatangan (contohnya USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) menunjukkan peraturan pasca-transkripsi yang kuat hanya pada tahap proteomik dan mempunyai profil ekspresi khusus jenis gentian berkedut perlahan/cepat (Rajah Tambahan 8C).
Plot gunung berapi A dan B yang membandingkan kluster perlahan dan pantas yang dikenal pasti oleh plot penghampiran dan unjuran manifold seragam (UMAP) dalam Rajah 1G–H. Titik berwarna mewakili transkrip atau protein yang berbeza secara signifikan pada FDR < 0.05, dan titik yang lebih gelap mewakili transkrip atau protein yang berbeza secara signifikan pada perubahan log > 1. Analisis statistik dua hala dilakukan menggunakan ujian DESeq2 Wald dengan nilai p terlaras Benjamini–Hochberg (transkriptomik) atau kaedah model linear Limma dengan analisis Bayesian empirikal diikuti oleh pelarasan Benjamini–Hochberg untuk berbilang perbandingan (proteomik). C Plot tandatangan gen atau protein yang diekspresikan secara berbeza yang dipilih antara gentian perlahan dan pantas. D Analisis pengayaan transkrip dan protein yang diekspresikan secara berbeza secara signifikan. Nilai bertindih diperkaya dalam kedua-dua set data, nilai transkriptom hanya diperkaya dalam transkriptom, dan nilai proteom hanya diperkaya dalam proteom. Analisis statistik dilakukan menggunakan pakej clusterProfiler dengan nilai-p terlaras Benjamini-Hochberg. E. Faktor transkripsi khusus jenis gentian yang dikenal pasti oleh SCENIC berdasarkan skor kekhususan pengawal selia yang diperoleh daripada SCENIC dan ekspresi mRNA berbeza antara jenis gentian. F. Pemprofilan faktor transkripsi terpilih yang diekspresikan secara berbeza antara gentian perlahan dan pantas.
Kemudian, kami menjalankan analisis perwakilan berlebihan bagi gen dan protein yang diwakili secara berbeza (Rajah 4D, Set Data Tambahan 13). Pengayaan laluan untuk ciri-ciri yang berbeza antara kedua-dua set data mendedahkan perbezaan yang dijangkakan, seperti proses pengoksidaan β asid lemak dan metabolisme keton (gentian perlahan), miofilamen/pengecutan otot (gentian cepat dan perlahan), dan proses katabolik karbohidrat (gentian cepat). Aktiviti fosfatase protein serina/treonina juga meningkat dalam gentian cepat, didorong oleh ciri-ciri seperti subunit fosfatase pengawalseliaan dan pemangkin (PPP3CB, PPP1R3D, dan PPP1R3A), yang diketahui mengawal metabolisme glikogen (47) (Rajah Tambahan 8D–E). Laluan lain yang diperkaya dalam gentian pantas termasuk badan pemprosesan (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) dalam proteom (Rajah Tambahan 8F), berpotensi terlibat dalam pengawalaturan pasca-transkripsi (48), dan aktiviti faktor transkripsi (SREBF1, RXRG, RORA) dalam transkriptom (Rajah Tambahan 8G). Gentian perlahan diperkaya dalam aktiviti oksidoreduktase (BDH1, DCXR, TXN2) (Rajah Tambahan 8H), pengikatan amida (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Rajah Tambahan 8I), matriks ekstraselular (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Rajah Tambahan 8J), dan aktiviti reseptor-ligan (FNDC5, SPX, NENF) (Rajah Tambahan 8K).
Untuk mendapatkan maklumat lanjut tentang pengawalaturan transkripsi yang mendasari ciri-ciri jenis gentian otot perlahan/cepat, kami menjalankan analisis pengayaan faktor transkripsi menggunakan SCENIC49 (Set Data Tambahan 14). Banyak faktor transkripsi diperkaya dengan ketara antara gentian otot cepat dan perlahan (Rajah 4E). Ini termasuk faktor transkripsi seperti MAFA, yang sebelum ini dikaitkan dengan perkembangan gentian otot cepat,50 serta beberapa faktor transkripsi yang sebelum ini tidak dikaitkan dengan program gen khusus jenis gentian otot. Antaranya, PITX1, EGR1, dan MYF6 adalah faktor transkripsi yang paling diperkaya dalam gentian otot cepat (Rajah 4E). Sebaliknya, ZSCAN30 dan EPAS1 (juga dikenali sebagai HIF2A) adalah faktor transkripsi yang paling diperkaya dalam gentian otot perlahan (Rajah 4E). Selaras dengan ini, MAFA diekspresikan pada tahap yang lebih tinggi di kawasan UMAP yang sepadan dengan gentian otot cepat, manakala EPAS1 mempunyai corak ekspresi yang bertentangan (Rajah 4F).
Selain gen pengekodan protein yang diketahui, terdapat banyak biotip RNA bukan pengekodan yang mungkin terlibat dalam pengawalaturan perkembangan dan penyakit manusia. 51, 52 Dalam set data transkriptom, beberapa RNA bukan pengekodan mempamerkan kekhususan jenis gentian (Rajah 5A dan Set Data Tambahan 15), termasuk LINC01405, yang sangat spesifik untuk gentian perlahan dan dilaporkan berkurangan dalam otot daripada pesakit dengan miopati mitokondria. 53 Sebaliknya, RP11-255P5.3, yang sepadan dengan gen lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, mempamerkan kekhususan jenis gentian pantas. Kedua-dua LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) dan RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) mempamerkan kekhususan otot rangka (Rajah Tambahan 9A–B) dan tidak mempunyai gen kontraktil yang diketahui dalam lingkungan genomik 1 Mb mereka, menunjukkan bahawa mereka memainkan peranan khusus dalam mengawal selia jenis gentian dan bukannya mengawal selia gen kontraktil bersebelahan. Profil ekspresi khusus jenis gentian perlahan/cepat bagi LINC01405 dan RP11-255P5.3, masing-masing, telah disahkan menggunakan RNAskop (Rajah 5B–C).
A. Transkrip RNA bukan pengekodan dikawal selia dengan ketara dalam gentian otot berkedut perlahan dan pantas. B. Imej RNAskop perwakilan yang menunjukkan kekhususan jenis gentian berkedut perlahan dan pantas bagi LINC01405 dan RP11-255P5.3, masing-masing. Bar skala = 50 μm. C. Kuantifikasi ekspresi RNA bukan pengekodan khusus jenis miofiber seperti yang ditentukan oleh RNAskop (n = 3 biopsi daripada individu bebas, membandingkan gentian otot cepat dan perlahan dalam setiap individu). Analisis statistik dilakukan menggunakan ujian-t Pelajar dua hujung. Plot kotak menunjukkan median dan kuartil pertama dan ketiga, dengan misai menunjukkan nilai minimum dan maksimum. D. Aliran kerja pengenalpastian protein mikrob de novo (dicipta dengan BioRender.com). E. Protein mikrob LINC01405_ORF408:17441:17358 diekspresikan secara khusus dalam gentian otot rangka perlahan (n=5 biopsi daripada peserta bebas, membandingkan gentian otot cepat dan perlahan dalam setiap peserta). Analisis statistik telah dijalankan menggunakan kaedah model linear Limm yang digabungkan dengan pendekatan Bayesian empirikal, diikuti dengan kaedah Benjamini-Hochberg untuk pelbagai perbandingan dengan pelarasan nilai-p. Plot kotak menunjukkan median, kuartil pertama dan ketiga, dengan misai menunjukkan nilai maksimum/minimum.
Baru-baru ini, kajian telah menunjukkan bahawa banyak transkrip bukan pengekodan putatif mengekod protein mikrob yang ditranskripsikan, yang sebahagiannya mengawal fungsi otot. 44, 55 Untuk mengenal pasti protein mikrob dengan potensi kekhususan jenis gentian, kami mencari set data proteom 1000 gentian kami menggunakan fail FASTA tersuai yang mengandungi urutan transkrip bukan pengekodan (n = 305) yang terdapat dalam set data transkriptom 1000 gentian (Rajah 5D). Kami mengenal pasti 197 protein mikrob daripada 22 transkrip berbeza, 71 daripadanya dikawal selia secara berbeza antara gentian otot rangka perlahan dan pantas (Rajah Tambahan 9C dan Set Data Tambahan 16). Bagi LINC01405, tiga produk protein mikrob telah dikenal pasti, salah satunya menunjukkan kekhususan gentian perlahan yang serupa dengan transkripnya (Rajah 5E dan Rajah Tambahan 9D). Oleh itu, kami mengenal pasti LINC01405 sebagai gen yang mengekod protein mikrob khusus untuk gentian otot rangka perlahan.
Kami membangunkan aliran kerja yang komprehensif untuk pencirian proteomik berskala besar bagi gentian otot individu dan mengenal pasti pengawal selia heterogeniti gentian dalam keadaan sihat. Kami menggunakan aliran kerja ini untuk memahami bagaimana miopati nemalin mempengaruhi heterogeniti gentian otot rangka. Miopati nemalin adalah penyakit otot yang diwarisi yang menyebabkan kelemahan otot dan, pada kanak-kanak yang terjejas, hadir dengan pelbagai komplikasi termasuk kesusahan pernafasan, skoliosis, dan mobiliti anggota badan yang terhad. 19,20 Biasanya, dalam miopati nemalin, varian patogen dalam gen seperti aktin alfa 1 (ACTA1) mengakibatkan dominasi komposisi miofiber gentian berkedut perlahan, walaupun kesan ini adalah heterogen. Satu pengecualian yang ketara ialah miopati nemalin troponin T1 (TNNT1), yang mempunyai dominasi gentian cepat. Oleh itu, pemahaman yang lebih baik tentang heterogeniti yang mendasari disregulasi gentian otot rangka yang diperhatikan dalam miopati nemalin boleh membantu menguraikan hubungan kompleks antara penyakit ini dan jenis miofiber.
Berbanding dengan kawalan sihat (n=3 setiap kumpulan), miofiber yang diasingkan daripada pesakit miopati nemalin dengan mutasi dalam gen ACTA1 dan TNNT1 menunjukkan atrofi atau distrofi miofiber yang ketara (Rajah 6A, Jadual Tambahan 3). Ini memberikan cabaran teknikal yang ketara untuk analisis proteomik disebabkan oleh jumlah bahan yang tersedia yang terhad. Walaupun begitu, kami dapat mengesan 2485 protein dalam 272 miofiber rangka. Selepas menapis sekurang-kurangnya 1000 protein yang diukur setiap gentian, 250 gentian telah menjalani analisis bioinformatik berikutnya. Selepas menapis, purata 1573 ± 359 protein setiap gentian telah diukur (Rajah Tambahan 10A, Set Data Tambahan 17–18). Terutamanya, walaupun terdapat pengurangan saiz gentian yang ketara, kedalaman proteom sampel pesakit miopati nemalin hanya berkurangan sedikit. Tambahan pula, pemprosesan data ini menggunakan fail FASTA kami sendiri (termasuk transkrip bukan pengekodan) membolehkan kami mengenal pasti lima protein mikrob dalam miofiber rangka daripada pesakit miopati nemalin (Set Data Tambahan 19). Julat dinamik proteom adalah jauh lebih luas, dan jumlah protein dalam kumpulan kawalan berkorelasi baik dengan keputusan analisis proteom 1000-fiber sebelumnya (Rajah Tambahan 10B–C).
A. Imej mikroskopik yang menunjukkan atrofi atau distrofi serat dan dominasi jenis serat yang berbeza berdasarkan MYH dalam miopati nemalin ACTA1 dan TNNT1 (NM). Bar skala = 100 μm. Untuk memastikan kebolehulangan pewarnaan pada pesakit ACTA1 dan TNNT1, tiga biopsi pesakit telah diwarnakan dua hingga tiga kali (empat bahagian setiap kes) sebelum memilih imej yang mewakili. B. Perkadaran jenis serat dalam peserta berdasarkan MYH. C. Plot analisis komponen utama (PCA) serat otot rangka pada pesakit dengan miopati nemalin dan kawalan. D. Serat otot rangka daripada pesakit dengan miopati nemalin dan kawalan yang diunjurkan ke plot PCA yang ditentukan daripada 1000 serat yang dianalisis dalam Rajah 2. Contohnya, plot gunung berapi yang membandingkan perbezaan antara peserta dengan miopati nemalin ACTA1 dan TNNT1 dan kawalan, dan antara peserta dengan miopati nemalin ACTA1 dan TNNT1. Bulatan berwarna menunjukkan protein yang berbeza secara signifikan pada π < 0.05, dan titik gelap menunjukkan protein yang berbeza secara signifikan pada FDR < 0.05. Analisis statistik dilakukan menggunakan kaedah model linear Limma dan kaedah Bayesian empirikal, diikuti dengan pelarasan nilai-p untuk berbilang perbandingan menggunakan kaedah Benjamini-Hochberg. H. Analisis pengayaan protein yang diekspresikan secara berbeza secara signifikan merentasi keseluruhan proteom dan dalam gentian jenis 1 dan 2A. Analisis statistik dilakukan menggunakan pakej clusterProfiler dan nilai-p yang diselaraskan oleh Benjamini-Hochberg. I, J. Plot analisis komponen utama (PCA) yang diwarnakan oleh matriks ekstraselular dan istilah ontologi gen mitokondria (GO).
Oleh kerana miopati nemalin boleh mempengaruhi perkadaran jenis miofiber yang mengekspresikan MYH dalam otot rangka,19,20 kami mula-mula mengkaji jenis miofiber yang mengekspresikan MYH pada pesakit dengan miopati nemalin dan kawalan. Kami menentukan jenis miofiber menggunakan kaedah tidak berat sebelah yang diterangkan sebelum ini untuk ujian miofiber 1000 (Rajah Tambahan 10D–E) dan sekali lagi gagal mengenal pasti miofiber 2X tulen (Rajah 6B). Kami memerhatikan kesan heterogen miopati nemalin pada jenis miofiber, kerana dua pesakit dengan mutasi ACTA1 mempunyai peningkatan perkadaran miofiber jenis 1, manakala dua pesakit dengan miopati nemalin TNNT1 mempunyai penurunan perkadaran miofiber jenis 1 (Rajah 6B). Sesungguhnya, ekspresi MYH2 dan isoform troponin pantas (TNNC2, TNNI2, dan TNNT3) menurun dalam miopati ACTA1-nemalin, manakala ekspresi MYH7 menurun dalam miopati TNNT1-nemalin (Rajah Tambahan 11A). Ini selaras dengan laporan terdahulu tentang penukaran jenis miofiber heterogen dalam miopati nemalin.19,20 Kami mengesahkan keputusan ini melalui imunohistokimia dan mendapati bahawa pesakit dengan miopati ACTA1-nemalin mempunyai dominasi miofiber jenis 1, manakala pesakit dengan miopati TNNT1-nemalin mempunyai corak yang bertentangan (Rajah 6A).
Pada peringkat proteom gentian tunggal, gentian otot rangka daripada pesakit miopati nemalin ACTA1 dan TNNT1 berkumpul dengan majoriti gentian kawalan, dengan gentian miopati nemalin TNNT1 secara amnya paling teruk terjejas (Rajah 6C). Ini amat jelas apabila memplot plot analisis komponen utama (PCA) gentian pseudo-inflasi untuk setiap pesakit, dengan pesakit miopati nemalin TNNT1 2 dan 3 muncul paling jauh daripada sampel kawalan (Rajah Tambahan 11B, Set Data Tambahan 20). Untuk lebih memahami bagaimana gentian daripada pesakit miopati berbanding dengan gentian yang sihat, kami menggunakan maklumat terperinci yang diperoleh daripada analisis proteomik 1,000 gentian daripada peserta dewasa yang sihat. Kami mengunjurkan gentian daripada set data miopati (pesakit dan kawalan miopati nemalin ACTA1 dan TNNT1) ke atas plot PCA yang diperoleh daripada analisis proteomik 1000 gentian (Rajah 6D). Taburan jenis gentian MYH di sepanjang PC2 dalam gentian kawalan adalah serupa dengan taburan gentian yang diperoleh daripada analisis proteomik 1000 gentian. Walau bagaimanapun, kebanyakan gentian dalam pesakit miopati nemalin beralih ke bawah PC2, bertindih dengan gentian berkedut pantas yang sihat, tanpa mengira jenis gentian MYH asal mereka. Oleh itu, walaupun pesakit dengan miopati nemalin ACTA1 menunjukkan peralihan ke arah gentian jenis 1 apabila diukur menggunakan kaedah berasaskan MYH, kedua-dua miopati nemalin ACTA1 dan miopati nemalin TNNT1 mengalihkan proteom gentian otot rangka ke arah gentian berkedut pantas.
Kemudian, kami membandingkan secara langsung setiap kumpulan pesakit dengan kawalan sihat dan mengenal pasti 256 dan 552 protein yang diekspresikan secara berbeza dalam miopati nemalin ACTA1 dan TNNT1, masing-masing (Rajah 6E–G dan Rajah Tambahan 11C, Set Data Tambahan 21). Analisis pengayaan gen mendedahkan penurunan protein mitokondria yang terselaras (Rajah 6H–I, Set Data Tambahan 22). Anehnya, walaupun terdapat dominasi jenis serat yang berbeza dalam miopati nemalin ACTA1 dan TNNT1, penurunan ini sepenuhnya bebas daripada jenis serat berasaskan MYH (Rajah 6H dan Rajah Tambahan 11D–I, Set Data Tambahan 23). Tiga protein mikrob juga dikawal selia dalam miopati nemalin ACTA1 atau TNNT1. Dua daripada mikroprotein ini, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (juga dikenali sebagai LINC00598 atau Lnc-FOXO1) dan ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), menunjukkan kelimpahan berbeza hanya dalam miofiber jenis 1. ENSG00000215483_TR14_ORF67 sebelum ini telah dilaporkan memainkan peranan dalam pengawalaturan kitaran sel. 56 Sebaliknya, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (bersamaan dengan LINC01798) telah meningkat dalam kedua-dua miofiber jenis 1 dan jenis 2A dalam miopati ACTA1-nemalin berbanding dengan kawalan sihat (Rajah Tambahan 12A, Set Data Tambahan 24). Sebaliknya, protein ribosom sebahagian besarnya tidak terjejas oleh miopati nemalin, walaupun RPS17 telah dikurangkan regulasinya dalam miopati nemalin ACTA1 (Rajah 6E).
Analisis pengayaan juga mendedahkan peningkatan regulasi proses sistem imun dalam miopati nemalin ACTA1 dan TNNT1, manakala lekatan sel juga meningkat dalam miopati nemalin TNNT1 (Rajah 6H). Pengayaan faktor ekstraselular ini dicerminkan oleh protein matriks ekstraselular yang mengalihkan PCA dalam PC1 dan PC2 ke arah negatif (iaitu, ke arah gentian yang paling terjejas) (Rajah 6J). Kedua-dua kumpulan pesakit menunjukkan peningkatan ekspresi protein ekstraselular yang terlibat dalam tindak balas imun dan mekanisme pembaikan sarkolema, seperti aneksin (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 dan protein interaksinya S100A1159 (Rajah Tambahan 12B–C). Proses ini sebelum ini dilaporkan dipertingkatkan dalam distrofi otot60 tetapi, setahu kami, sebelum ini tidak dikaitkan dengan miopati nemalin. Fungsi normal jentera molekul ini diperlukan untuk pembaikan sarkolema selepas kecederaan dan untuk gabungan miosit yang baru terbentuk dengan miofiber58,61. Oleh itu, peningkatan aktiviti proses ini dalam kedua-dua kumpulan pesakit menunjukkan tindak balas reparatif terhadap kecederaan yang disebabkan oleh ketidakstabilan miofiber.
Kesan setiap miopati nemalin berkorelasi baik (r = 0.736) dan menunjukkan pertindihan yang munasabah (Rajah Tambahan 11A–B), menunjukkan bahawa miopati nemalin ACTA1 dan TNNT1 mempunyai kesan yang serupa pada proteom. Walau bagaimanapun, sesetengah protein hanya dikawal selia dalam miopati nemalin ACTA1 atau TNNT1 (Rajah Tambahan 11A dan C). Protein profibrotik MFAP4 adalah salah satu protein yang paling banyak dikawal selia dalam miopati nemalin TNNT1 tetapi kekal tidak berubah dalam miopati nemalin ACTA1. SKIC8, komponen kompleks PAF1C yang bertanggungjawab untuk mengawal selia transkripsi gen HOX, telah dikawal selia secara menurun dalam miopati nemalin TNNT1 tetapi tidak terjejas dalam miopati nemalin ACTA1 (Rajah Tambahan 11A). Perbandingan langsung miopati nemalin ACTA1 dan TNNT1 mendedahkan pengurangan protein mitokondria yang lebih besar dan peningkatan protein sistem imun dalam miopati nemalin TNNT1 (Rajah 6G–H dan Rajah Tambahan 11C dan 11H–I). Data ini selaras dengan atrofi/distrofi yang lebih besar yang diperhatikan dalam miopati nemalin TNNT1 berbanding miopati nemalin TNNT1 (Rajah 6A), menunjukkan bahawa miopati nemalin TNNT1 mewakili bentuk penyakit yang lebih teruk.
Untuk menilai sama ada kesan miopati nemalin yang diperhatikan berterusan pada keseluruhan peringkat otot, kami menjalankan analisis proteomik pukal biopsi otot daripada kohort pesakit miopati nemalin TNNT1 yang sama dan membandingkannya dengan kawalan (n=3 setiap kumpulan) (Rajah Tambahan 13A, Set Data Tambahan 25). Seperti yang dijangkakan, kawalan berkait rapat dalam analisis komponen utama, manakala pesakit miopati nemalin TNNT1 mempamerkan kebolehubahan antara sampel yang lebih tinggi serupa dengan yang dilihat dalam analisis gentian tunggal (Rajah Tambahan 13B). Analisis pukal menghasilkan semula protein yang diekspresikan secara berbeza (Rajah Tambahan 13C, Set Data Tambahan 26) dan proses biologi (Rajah Tambahan 13D, Set Data Tambahan 27) yang diserlahkan dengan membandingkan gentian individu, tetapi kehilangan keupayaan untuk membezakan antara jenis gentian yang berbeza dan gagal mengambil kira kesan penyakit heterogen merentasi gentian.
Secara keseluruhannya, data ini menunjukkan bahawa proteomik miofiber tunggal boleh menjelaskan ciri-ciri biologi klinikal yang tidak dapat dikesan oleh kaedah yang disasarkan seperti imunoblotting. Selain itu, data ini menonjolkan batasan penggunaan penaipan gentian aktin (MYH) sahaja untuk menggambarkan penyesuaian fenotip. Sesungguhnya, walaupun penukaran jenis gentian berbeza antara miopati nemalin aktin dan troponin, kedua-dua miopati nemalin memisahkan penaipan gentian MYH daripada metabolisme gentian otot rangka ke arah proteom otot yang lebih pantas dan kurang oksidatif.
Heterogeniti selular adalah penting untuk tisu memenuhi keperluan mereka yang pelbagai. Dalam otot rangka, ini sering digambarkan sebagai jenis gentian yang dicirikan oleh tahap penghasilan daya dan kelesuan yang berbeza. Walau bagaimanapun, adalah jelas bahawa ini hanya menjelaskan sebahagian kecil daripada kebolehubahan gentian otot rangka, yang jauh lebih berubah-ubah, kompleks dan pelbagai rupa daripada yang difikirkan sebelum ini. Kemajuan teknologi kini telah memberi penerangan tentang faktor-faktor yang mengawal selia gentian otot rangka. Malah, data kami menunjukkan bahawa gentian jenis 2X mungkin bukan subjenis gentian otot rangka yang berbeza. Selain itu, kami mengenal pasti protein metabolik, protein ribosom dan protein berkaitan sel sebagai penentu utama heterogeniti gentian otot rangka. Dengan menggunakan aliran kerja proteomik kami kepada sampel pesakit dengan miopati nematod, kami selanjutnya menunjukkan bahawa penaipan gentian berasaskan MYH tidak mencerminkan sepenuhnya heterogeniti otot rangka, terutamanya apabila sistem terganggu. Malah, tanpa mengira jenis gentian berasaskan MYH, miopati nematod mengakibatkan peralihan ke arah gentian yang lebih pantas dan kurang oksidatif.
Serat otot rangka telah dikelaskan sejak abad ke-19. Analisis omics terkini telah membolehkan kita mula memahami profil ekspresi pelbagai jenis serat MYH dan tindak balasnya terhadap rangsangan yang berbeza. Seperti yang diterangkan di sini, pendekatan omics juga mempunyai kelebihan kepekaan yang lebih tinggi untuk mengukur penanda jenis serat berbanding kaedah berasaskan antibodi tradisional, tanpa bergantung pada pengkuantitian satu (atau beberapa) penanda untuk menentukan jenis serat otot rangka. Kami menggunakan aliran kerja transkriptomik dan proteomik pelengkap dan mengintegrasikan hasilnya untuk mengkaji pengawalaturan transkripsi dan pasca-transkripsi bagi heterogeniti serat dalam serat otot rangka manusia. Aliran kerja ini mengakibatkan kegagalan untuk mengenal pasti serat jenis 2X tulen pada tahap protein dalam vastus lateralis kohort lelaki muda kami yang sihat. Ini selaras dengan kajian serat tunggal sebelumnya yang mendapati <1% serat 2X tulen dalam vastus lateralis yang sihat, walaupun ini harus disahkan pada otot lain pada masa hadapan. Percanggahan antara pengesanan serat 2X yang hampir tulen pada tahap mRNA dan hanya serat 2A/2X campuran pada tahap protein adalah membingungkan. Ekspresi mRNA isoform MYH bukanlah sirkadian,67 menunjukkan bahawa kita tidak mungkin "terlepas pandang" isyarat permulaan MYH2 dalam gentian 2X yang nampaknya tulen pada tahap RNA. Satu penjelasan yang mungkin, walaupun hanya hipotesis, mungkin perbezaan dalam kestabilan protein dan/atau mRNA antara isoform MYH. Sesungguhnya, tiada gentian pantas yang 100% tulen untuk sebarang isoform MYH, dan tidak jelas sama ada tahap ekspresi mRNA MYH1 dalam julat 70–90% akan menghasilkan kelimpahan MYH1 dan MYH2 yang sama pada tahap protein. Walau bagaimanapun, apabila mempertimbangkan keseluruhan transkriptom atau proteom, analisis kluster dengan yakin hanya boleh mengenal pasti dua kluster berbeza yang mewakili gentian otot rangka perlahan dan pantas, tanpa mengira komposisi MYH yang tepat. Ini selaras dengan analisis menggunakan pendekatan transkriptomi nukleus tunggal, yang biasanya hanya mengenal pasti dua kluster mionuklear yang berbeza. 68, 69, 70 Tambahan pula, walaupun kajian proteomik terdahulu telah mengenal pasti gentian jenis 2X, gentian ini tidak berkelompok secara berasingan daripada gentian pantas yang lain dan hanya menunjukkan sebilangan kecil protein yang berbeza jumlahnya berbanding jenis gentian lain berdasarkan MYH. 14 Keputusan ini menunjukkan bahawa kita harus kembali kepada pandangan awal abad ke-20 tentang klasifikasi gentian otot, yang membahagikan gentian otot rangka manusia bukan kepada tiga kelas berbeza berdasarkan MYH, tetapi kepada dua kelompok berdasarkan sifat metabolik dan kontraktilnya. 63
Lebih penting lagi, heterogeniti miofiber harus dipertimbangkan sepanjang pelbagai dimensi. Kajian "omics" sebelum ini telah menunjukkan ke arah ini, menunjukkan bahawa gentian otot rangka tidak membentuk kelompok diskret tetapi disusun sepanjang kontinum. 11, 13, 14, 64, 71 Di sini, kami menunjukkan bahawa, selain perbezaan dalam sifat kontraktil dan metabolik otot rangka, miofiber boleh dibezakan melalui ciri-ciri yang berkaitan dengan interaksi sel-sel dan mekanisme terjemahan. Sesungguhnya, kami mendapati heterogeniti ribosom dalam gentian otot rangka yang menyumbang kepada heterogeniti bebas daripada jenis gentian perlahan dan pantas. Punca asas heterogeniti miofiber yang substansial ini, bebas daripada jenis gentian perlahan dan pantas, masih tidak jelas, tetapi ia mungkin menunjukkan organisasi ruang khusus dalam fasikel otot yang bertindak balas secara optimum terhadap daya dan beban tertentu,72 komunikasi selular atau organ khusus dengan jenis sel lain dalam persekitaran mikro otot73,74,75 atau perbezaan dalam aktiviti ribosom dalam miofiber individu. Sesungguhnya, heteroplasmi ribosom, sama ada melalui penggantian paralog RPL3 dan RPL3L atau pada tahap 2′O-metilasi rRNA, telah terbukti dikaitkan dengan hipertrofi otot rangka76,77. Aplikasi multi-omik dan spatial yang digabungkan dengan pencirian fungsi miofiber individu akan memajukan lagi pemahaman kita tentang biologi otot pada tahap multi-omik78.
Dengan menganalisis proteom miofiber tunggal daripada pesakit dengan miopati nemalin, kami juga menunjukkan kegunaan, keberkesanan dan kebolehgunaan proteomik miofiber tunggal untuk menjelaskan patofisiologi klinikal otot rangka. Selain itu, dengan membandingkan aliran kerja kami dengan analisis proteomik global, kami dapat menunjukkan bahawa proteomik miofiber tunggal menghasilkan kedalaman maklumat yang sama seperti proteomik tisu global dan melanjutkan kedalaman ini dengan mengambil kira heterogeniti antara gentian dan jenis miofiber. Selain perbezaan yang dijangkakan (walaupun berubah-ubah) dalam nisbah jenis gentian yang diperhatikan dalam miopati nemalin ACTA1 dan TNNT1 berbanding kawalan sihat,19 kami juga memerhatikan pembentukan semula oksidatif dan ekstraselular tanpa mengira penukaran jenis gentian yang dimediasi MYH. Fibrosis sebelum ini telah dilaporkan dalam miopati nemalin TNNT1.19 Walau bagaimanapun, analisis kami dibina berdasarkan penemuan ini dengan turut mendedahkan peningkatan tahap protein berkaitan tekanan yang dirembeskan secara ekstraselular, seperti aneksin, yang terlibat dalam mekanisme pembaikan sarkolema, dalam miofiber daripada pesakit dengan miopati nemalin ACTA1 dan TNNT1.57,58,59 Kesimpulannya, peningkatan tahap aneksin dalam miofiber daripada pesakit dengan miopati nemalin mungkin mewakili tindak balas selular untuk membaiki miofiber atrofi yang teruk.
Walaupun kajian ini mewakili analisis keseluruhan otot-omik gentian tunggal terbesar bagi manusia setakat ini, ia bukan tanpa batasan. Kami mengasingkan gentian otot rangka daripada sampel peserta yang agak kecil dan homogen dan satu otot (vastus lateralis). Oleh itu, adalah mustahil untuk mengecualikan kewujudan populasi gentian tertentu merentasi jenis otot dan pada tahap ekstrem fisiologi otot. Contohnya, kita tidak boleh mengecualikan kemungkinan subset gentian ultrapantas (contohnya, gentian 2X tulen) muncul dalam pelari pecut yang sangat terlatih dan/atau atlet kekuatan79 atau semasa tempoh ketidakaktifan otot66,80. Tambahan pula, saiz sampel peserta yang terhad menghalang kami daripada menyiasat perbezaan jantina dalam heterogeniti gentian, kerana nisbah jenis gentian diketahui berbeza antara lelaki dan wanita. Tambahan pula, kami tidak dapat menjalankan analisis transkriptomik dan proteomik pada gentian otot yang sama atau sampel daripada peserta yang sama. Ketika kami dan pihak lain terus mengoptimumkan analisis sel tunggal dan miofiber tunggal menggunakan analisis omics untuk mencapai input sampel ultra-rendah (seperti yang ditunjukkan di sini dalam analisis gentian daripada pesakit dengan miopati mitokondria), peluang untuk menggabungkan pendekatan multi-omics (dan berfungsi) dalam gentian otot tunggal menjadi jelas.
Secara keseluruhan, data kami mengenal pasti dan menerangkan pemacu transkripsi dan pasca-transkripsi bagi heterogeniti otot rangka. Secara khususnya, kami membentangkan data yang mencabar dogma lama dalam fisiologi otot rangka yang berkaitan dengan definisi jenis gentian berasaskan MYH klasik. Kami berharap dapat memperbaharui perdebatan ini dan akhirnya memikirkan semula pemahaman kami tentang klasifikasi dan heterogeniti gentian otot rangka.
Empat belas peserta Kaukasia (12 lelaki dan 2 wanita) secara sukarela bersetuju untuk mengambil bahagian dalam kajian ini. Kajian ini telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Hospital Universiti Ghent (BC-10237), mematuhi Deklarasi Helsinki 2013, dan telah didaftarkan di ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Ciri-ciri umum peserta dibentangkan dalam Jadual Tambahan 1. Selepas mendapatkan persetujuan bertulis secara lisan dan bertulis, peserta menjalani pemeriksaan perubatan sebelum penyertaan akhir dalam kajian. Peserta berumur muda (22–42 tahun), sihat (tiada keadaan perubatan, tiada sejarah merokok), dan sederhana aktif secara fizikal. Pengambilan oksigen maksimum ditentukan menggunakan ergometer langkah untuk menilai kecergasan fizikal seperti yang diterangkan sebelum ini. 81
Sampel biopsi otot dikumpulkan semasa rehat dan dalam keadaan puasa sebanyak tiga kali, dengan jarak 14 hari. Oleh kerana sampel ini dikumpulkan sebagai sebahagian daripada kajian yang lebih besar, peserta mengambil plasebo (laktosa), antagonis reseptor H1 (540 mg fexofenadine), atau antagonis reseptor H2 (40 mg famotidine) 40 minit sebelum biopsi. Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa antagonis reseptor histamin ini tidak menjejaskan kecergasan otot rangka semasa rehat81, dan tiada pengelompokan berkaitan keadaan diperhatikan dalam plot kawalan kualiti kami (Rajah Tambahan 3 dan 6). Diet piawai (41.4 kcal/kg berat badan, 5.1 g/kg karbohidrat berat badan, 1.4 g/kg protein berat badan, dan 1.6 g/kg lemak berat badan) dikekalkan selama 48 jam sebelum setiap hari eksperimen, dan sarapan piawai (1.5 g/kg karbohidrat berat badan) dimakan pada waktu pagi hari eksperimen. Di bawah anestesia tempatan (0.5 ml 1% lidokain tanpa epinefrin), biopsi otot diperoleh daripada otot vastus lateralis menggunakan aspirasi Bergström perkutan.82 Sampel otot segera dibenamkan dalam RNA kemudian disimpan pada suhu 4°C sehingga pembedahan gentian manual (sehingga 3 hari).
Bundel miofiber yang baru diasingkan dipindahkan ke medium RNAlater segar dalam piring kultur. Miofiber individu kemudiannya dibedah secara manual menggunakan stereomikroskop dan pinset halus. Dua puluh lima gentian dibedah daripada setiap biopsi, dengan memberi perhatian khusus kepada pemilihan gentian daripada kawasan biopsi yang berbeza. Selepas dibedah, setiap gentian direndam perlahan-lahan dalam 3 μl penimbal lisis (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) yang mengandungi enzim proteinase K dan DNase untuk membuang protein dan DNA yang tidak diingini. Lisis sel dan penyingkiran protein/DNA kemudiannya dimulakan dengan vorteks ringkas, memutarkan cecair dalam mikroemparan, dan pengeraman pada suhu bilik (10 minit). Lisat kemudiannya diinkubasi dalam pengitar haba (T100, Bio-Rad) pada suhu 37°C selama 5 minit, 75°C selama 5 minit, dan kemudian disimpan serta-merta pada suhu -80°C sehingga diproses selanjutnya.
Pustaka RNA poliadenylasi yang serasi dengan Illumina telah disediakan daripada 2 µl lisat miofiber menggunakan Kit Persediaan Pustaka mRNA-Seq QuantSeq-Pool 3′ (Lexogen). Kaedah terperinci boleh didapati dalam manual pengeluar. Proses ini bermula dengan sintesis cDNA untaian pertama melalui transkripsi terbalik, di mana pengecam molekul unik (UMI) dan kod bar i1 khusus sampel diperkenalkan untuk memastikan pengumpulan sampel dan mengurangkan kebolehubahan teknikal semasa pemprosesan hiliran. cDNA daripada 96 miofiber kemudiannya dikumpulkan dan ditulenkan dengan manik magnet, selepas itu RNA dikeluarkan dan sintesis untaian kedua dilakukan menggunakan primer rawak. Pustaka ditulenkan dengan manik magnet, tag i5/i7 khusus kolam ditambah, dan PCR dikuatkan. Langkah penulenan terakhir menghasilkan pustaka yang serasi dengan Illumina. Kualiti setiap kolam pustaka dinilai menggunakan Kit Analisis DNA Serpihan Kecil Sensitiviti Tinggi (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Berdasarkan kuantifikasi Qubit, kumpulan telah dikumpulkan selanjutnya pada kepekatan ekuimolar (2 nM). Kumpulan yang terhasil kemudiannya dijujukan pada instrumen NovaSeq 6000 dalam mod piawai menggunakan Kit Reagen NovaSeq S2 (1 × 100 nukleotida) dengan pemuatan 2 nM (4% PhiX).
Saluran paip kami adalah berdasarkan saluran paip analisis data QuantSeq Pool Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Data pertama kali dinyahmultiplex dengan bcl2fastq2 (v2.20.0) berdasarkan indeks i7/i5. Bacaan 2 kemudiannya dinyahmultiplex dengan idemux (v0.1.6) berdasarkan kod bar sampel i1 dan jujukan UMI diekstrak dengan umi_tools (v1.0.1). Bacaan kemudian dipangkas dengan cutadapt (v3.4) dalam berbilang pusingan untuk mengalih keluar bacaan pendek (<20 inci panjang) atau bacaan yang hanya terdiri daripada jujukan penyesuai. Bacaan kemudiannya diselaraskan dengan genom manusia menggunakan STAR (v2.6.0c) dan fail BAM diindeks dengan SAMtools (v1.11). Bacaan pendua dialih keluar menggunakan umi_tools (v1.0.1). Akhir sekali, pengiraan penjajaran dilakukan menggunakan featureCounts dalam Subread (v2.0.3). Kawalan kualiti telah dijalankan menggunakan FastQC (v0.11.9) pada beberapa peringkat pertengahan saluran paip.
Semua pemprosesan dan visualisasi bioinformatik selanjutnya telah dilakukan dalam R (v4.2.3), terutamanya menggunakan aliran kerja Seurat (v4.4.0). 83 Oleh itu, nilai UMI individu dan matriks metadata telah diubah menjadi objek Seurat. Gen yang diekspresikan dalam kurang daripada 30% daripada semua gentian telah dialih keluar. Sampel berkualiti rendah telah dialih keluar berdasarkan ambang minimum 1000 nilai UMI dan 1000 gen yang dikesan. Akhirnya, 925 gentian melepasi semua langkah penapisan kawalan kualiti. Nilai UMI telah dinormalisasi menggunakan kaedah Seurat SCTransform v2, 84 termasuk semua 7418 ciri yang dikesan, dan perbezaan antara peserta telah diregresi keluar. Semua metadata yang berkaitan boleh didapati dalam Set Data Tambahan 28.
Masa siaran: 10-Sep-2025