Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk hasil terbaik, kami mengesyorkan menggunakan pelayar yang lebih baharu (atau melumpuhkan mod keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Penentuan model haiwan bagi perubahan modik (MC) merupakan asas penting untuk mengkaji MC. Lima puluh empat ekor arnab Putih New Zealand dibahagikan kepada kumpulan operasi palsu, kumpulan implantasi otot (kumpulan ME) dan kumpulan implantasi nukleus pulposus (kumpulan NPE). Dalam kumpulan NPE, cakera intervertebral didedahkan melalui pendekatan pembedahan lumbar anterolateral dan jarum digunakan untuk menebuk badan vertebra L5 berhampiran plat hujung. NP diekstrak daripada cakera intervertebral L1/2 dengan picagari dan disuntik ke dalamnya. Menebuk lubang pada tulang subkondral. Prosedur pembedahan dan kaedah penggerudian dalam kumpulan implantasi otot dan kumpulan operasi palsu adalah sama seperti dalam kumpulan implantasi NP. Dalam kumpulan ME, sekeping otot diletakkan ke dalam lubang, manakala dalam kumpulan operasi palsu, tiada apa yang diletakkan ke dalam lubang. Selepas pembedahan, pengimbasan MRI dan ujian biologi molekul telah dilakukan. Isyarat dalam kumpulan NPE berubah, tetapi tiada perubahan isyarat yang jelas dalam kumpulan operasi palsu dan kumpulan ME. Pemerhatian histologi menunjukkan bahawa percambahan tisu yang tidak normal diperhatikan di tapak implantasi, dan ekspresi IL-4, IL-17 dan IFN-γ meningkat dalam kumpulan NPE. Implantasi NP ke dalam tulang subkondral boleh membentuk model haiwan MC.
Perubahan modik (MC) ialah lesi pada plat hujung vertebra dan sumsum tulang bersebelahan yang boleh dilihat pada pengimejan resonans magnetik (MRI). Ia agak biasa berlaku pada individu yang mempunyai simptom yang berkaitan1. Banyak kajian telah menekankan kepentingan MC kerana kaitannya dengan sakit belakang bawah (LBP)2,3. de Roos et al.4 dan Modic et al.5 secara bebas pertama kali menerangkan tiga jenis keabnormalan isyarat subkondral yang berbeza dalam sumsum tulang vertebra. Perubahan jenis I modik adalah hipointens pada urutan berwajaran T1 (T1W) dan hiperintens pada urutan berwajaran T2 (T2W). Lesi ini mendedahkan plat hujung fisur dan tisu granulasi vaskular bersebelahan dalam sumsum tulang. Perubahan jenis II modik menunjukkan isyarat yang tinggi pada kedua-dua urutan T1W dan T2W. Dalam jenis lesi ini, kemusnahan plat hujung boleh didapati, serta penggantian lemak histologi sumsum tulang bersebelahan. Perubahan jenis III modik menunjukkan isyarat yang rendah dalam urutan T1W dan T2W. Lesi sklerotik yang sepadan dengan plat hujung telah diperhatikan6. MC dianggap sebagai penyakit patologi tulang belakang dan berkait rapat dengan banyak penyakit degeneratif tulang belakang7,8,9.
Memandangkan data yang ada, beberapa kajian telah memberikan pandangan terperinci tentang etiologi dan mekanisme patologi MC. Albert et al. mencadangkan bahawa MC mungkin disebabkan oleh herniasi cakera8. Hu et al. mengaitkan MC dengan degenerasi cakera yang teruk10. Kroc mencadangkan konsep "pecah cakera dalaman," yang menyatakan bahawa trauma cakera berulang boleh menyebabkan mikrokoyakan pada plat hujung. Selepas pembentukan celah, kemusnahan plat hujung oleh nukleus pulposus (NP) boleh mencetuskan tindak balas autoimun, yang seterusnya membawa kepada perkembangan MC11. Ma et al. berkongsi pandangan yang serupa dan melaporkan bahawa autoimun yang disebabkan oleh NP memainkan peranan penting dalam patogenesis MC12.
Sel sistem imun, terutamanya limfosit penolong T CD4+, memainkan peranan penting dalam patogenesis autoimun13. Subkumpulan Th17 yang baru ditemui menghasilkan sitokin proinflamasi IL-17, menggalakkan ekspresi kemokin dan merangsang sel T dalam organ yang rosak untuk menghasilkan IFN-γ14. Sel Th2 juga memainkan peranan unik dalam patogenesis tindak balas imun. Ekspresi IL-4 sebagai sel Th2 yang mewakili boleh menyebabkan akibat imunopatologi yang teruk15.
Walaupun banyak kajian klinikal telah dijalankan ke atas MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, masih terdapat kekurangan model eksperimen haiwan yang sesuai yang boleh meniru proses MC yang kerap berlaku pada manusia dan boleh digunakan untuk menyiasat etiologi atau rawatan baharu seperti terapi yang disasarkan. Sehingga kini, hanya beberapa model haiwan MC telah dilaporkan mengkaji mekanisme patologi yang mendasarinya.
Berdasarkan teori autoimun yang dicadangkan oleh Albert dan Ma, kajian ini telah mewujudkan model MC arnab yang mudah dan boleh dihasilkan semula dengan memindahkan NP secara automatik berhampiran plat hujung vertebra yang digerudi. Objektif lain adalah untuk memerhatikan ciri-ciri histologi model haiwan dan menilai mekanisme khusus NP dalam perkembangan MC. Untuk tujuan ini, kami menggunakan teknik seperti biologi molekul, MRI dan kajian histologi untuk mengkaji perkembangan MC.
Dua ekor arnab mati akibat pendarahan semasa pembedahan, dan empat ekor arnab mati semasa anestesia semasa MRI. Baki 48 ekor arnab terselamat dan tidak menunjukkan tanda-tanda tingkah laku atau neurologi selepas pembedahan.
MRI menunjukkan bahawa keamatan isyarat tisu terbenam dalam lubang yang berbeza adalah berbeza. Keamatan isyarat badan vertebra L5 dalam kumpulan NPE secara beransur-ansur berubah pada 12, 16 dan 20 minggu selepas penyisipan (urutan T1W menunjukkan isyarat rendah, dan urutan T2W menunjukkan isyarat campuran ditambah isyarat rendah) (Rajah 1C), manakala penampilan MRI bagi dua kumpulan bahagian terbenam yang lain kekal agak stabil dalam tempoh yang sama (Rajah 1A, B).
(A) MRI berjujukan representatif tulang belakang lumbar arnab pada 3 titik masa. Tiada keabnormalan isyarat ditemui dalam imej kumpulan operasi palsu. (B) Ciri-ciri isyarat badan vertebra dalam kumpulan ME adalah serupa dengan yang terdapat dalam kumpulan operasi palsu, dan tiada perubahan isyarat ketara diperhatikan di tapak pembenaman dari semasa ke semasa. (C) Dalam kumpulan NPE, isyarat rendah jelas kelihatan dalam urutan T1W, dan isyarat campuran dan isyarat rendah jelas kelihatan dalam urutan T2W. Dari tempoh 12 minggu hingga tempoh 20 minggu, isyarat tinggi sporadis yang mengelilingi isyarat rendah dalam urutan T2W berkurangan.
Hiperplasia tulang yang jelas dapat dilihat di tapak implantasi badan vertebra dalam kumpulan NPE, dan hiperplasia tulang berlaku lebih cepat dari 12 hingga 20 minggu (Rajah 2C) berbanding dengan kumpulan NPE, tiada perubahan ketara diperhatikan pada badan vertebra yang dimodelkan; kumpulan Sham dan kumpulan ME (Rajah 2C) 2A,B).
(A) Permukaan badan vertebra pada bahagian yang diimplan sangat licin, lubangnya sembuh dengan baik, dan tiada hiperplasia pada badan vertebra. (B) Bentuk tapak yang diimplan dalam kumpulan ME adalah serupa dengan bentuk dalam kumpulan pembedahan palsu, dan tiada perubahan ketara pada rupa tapak yang diimplan dari semasa ke semasa. (C) Hiperplasia tulang berlaku di tapak yang diimplan dalam kumpulan NPE. Hiperplasia tulang meningkat dengan cepat dan juga meluas melalui cakera intervertebral ke badan vertebra kontralateral.
Analisis histologi memberikan maklumat yang lebih terperinci tentang pembentukan tulang. Rajah 3 menunjukkan gambar-gambar bahagian selepas pembedahan yang diwarnakan dengan H&E. Dalam kumpulan pembedahan palsu, kondrosit tersusun dengan baik dan tiada percambahan sel dikesan (Rajah 3A). Keadaan dalam kumpulan ME adalah serupa dengan kumpulan pembedahan palsu (Rajah 3B). Walau bagaimanapun, dalam kumpulan NPE, sebilangan besar kondrosit dan percambahan sel seperti NP diperhatikan di tapak implantasi (Rajah 3C);
(A) Trabekula boleh dilihat berhampiran plat hujung, kondrosit tersusun kemas dengan saiz dan bentuk sel yang seragam dan tiada percambahan (40 kali ganda). (B) Keadaan tapak implantasi dalam kumpulan ME adalah serupa dengan kumpulan palsu. Trabekula dan kondrosit boleh dilihat, tetapi tiada percambahan yang jelas di tapak implantasi (40 kali ganda). (B) Dapat dilihat bahawa kondrosit dan sel seperti NP membiak dengan ketara, dan bentuk serta saiz kondrosit tidak sekata (40 kali ganda).
Ekspresi mRNA interleukin 4 (IL-4), mRNA interleukin 17 (IL-17), dan mRNA interferon γ (IFN-γ) diperhatikan dalam kedua-dua kumpulan NPE dan ME. Apabila tahap ekspresi gen sasaran dibandingkan, ekspresi gen IL-4, IL-17, dan IFN-γ meningkat dengan ketara dalam kumpulan NPE berbanding dengan kumpulan ME dan kumpulan operasi palsu (Rajah 4) (P < 0.05). Berbanding dengan kumpulan operasi palsu, tahap ekspresi IL-4, IL-17, dan IFN-γ dalam kumpulan ME hanya meningkat sedikit dan tidak mencapai perubahan statistik (P > 0.05).
Ekspresi mRNA IL-4, IL-17 dan IFN-γ dalam kumpulan NPE menunjukkan trend yang jauh lebih tinggi berbanding kumpulan operasi palsu dan kumpulan ME (P < 0.05).
Sebaliknya, tahap ekspresi dalam kumpulan ME tidak menunjukkan perbezaan yang ketara (P>0.05).
Analisis Western blot telah dijalankan menggunakan antibodi yang tersedia secara komersial terhadap IL-4 dan IL-17 untuk mengesahkan corak ekspresi mRNA yang diubah. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5A,B, berbanding dengan kumpulan ME dan kumpulan operasi palsu, tahap protein IL-4 dan IL-17 dalam kumpulan NPE meningkat dengan ketara (P < 0.05). Berbanding dengan kumpulan operasi palsu, tahap protein IL-4 dan IL-17 dalam kumpulan ME juga gagal mencapai perubahan yang signifikan secara statistik (P> 0.05).
(A) Tahap protein IL-4 dan IL-17 dalam kumpulan NPE adalah jauh lebih tinggi berbanding kumpulan ME dan kumpulan plasebo (P < 0.05). (B) Histogram Western blot.
Disebabkan bilangan sampel manusia yang diperoleh semasa pembedahan adalah terhad, kajian yang jelas dan terperinci tentang patogenesis MC agak sukar. Kami cuba mewujudkan model haiwan MC untuk mengkaji mekanisme patologi yang berpotensi. Pada masa yang sama, penilaian radiologi, penilaian histologi dan penilaian biologi molekul telah digunakan untuk mengikuti perjalanan MC yang disebabkan oleh autograft NP. Hasilnya, model implantasi NP menghasilkan perubahan keamatan isyarat secara beransur-ansur dari titik masa 12 minggu kepada 20 minggu (isyarat rendah campuran dalam urutan T1W dan isyarat rendah dalam urutan T2W), menunjukkan perubahan tisu, dan penilaian biologi histologi dan molekul mengesahkan keputusan kajian radiologi.
Keputusan eksperimen ini menunjukkan bahawa perubahan visual dan histologi berlaku di tapak pelanggaran badan vertebra dalam kumpulan NPE. Pada masa yang sama, ekspresi gen IL-4, IL-17 dan IFN-γ, serta IL-4, IL-17 dan IFN-γ diperhatikan, menunjukkan bahawa pelanggaran tisu nukleus pulposus autologus dalam badan vertebra boleh menyebabkan satu siri perubahan isyarat dan morfologi. Adalah mudah untuk mendapati bahawa ciri-ciri isyarat badan vertebra model haiwan (isyarat rendah dalam urutan T1W, isyarat campuran dan isyarat rendah dalam urutan T2W) sangat serupa dengan sel vertebra manusia, dan ciri-ciri MRI juga mengesahkan pemerhatian histologi dan anatomi kasar, iaitu, perubahan dalam sel badan vertebra adalah progresif. Walaupun tindak balas keradangan yang disebabkan oleh trauma akut mungkin muncul sejurus selepas tusukan, keputusan MRI menunjukkan bahawa perubahan isyarat yang semakin meningkat muncul 12 minggu selepas tusukan dan berterusan sehingga 20 minggu tanpa sebarang tanda pemulihan atau pembalikan perubahan MRI. Keputusan ini menunjukkan bahawa NP vertebra autologus adalah kaedah yang boleh dipercayai untuk mewujudkan MV progresif dalam arnab.
Model tusukan ini memerlukan kemahiran, masa dan usaha pembedahan yang mencukupi. Dalam eksperimen awal, pembedahan atau rangsangan berlebihan pada struktur ligamen paravertebral boleh mengakibatkan pembentukan osteofit vertebra. Penjagaan harus diambil agar tidak merosakkan atau merengsakan cakera bersebelahan. Memandangkan kedalaman penembusan mesti dikawal untuk mendapatkan hasil yang konsisten dan boleh dihasilkan semula, kami secara manual membuat palam dengan memotong sarung jarum sepanjang 3 mm. Menggunakan palam ini memastikan kedalaman penggerudian yang seragam dalam badan vertebra. Dalam eksperimen awal, tiga pakar bedah ortopedik yang terlibat dalam pembedahan mendapati jarum 16-tolok lebih mudah digunakan berbanding jarum 18-tolok atau kaedah lain. Untuk mengelakkan pendarahan yang berlebihan semasa penggerudian, memegang jarum secara pegun untuk seketika akan menyediakan lubang sisipan yang lebih sesuai, menunjukkan bahawa tahap MC tertentu boleh dikawal dengan cara ini.
Walaupun banyak kajian telah menyasarkan MC, sedikit yang diketahui tentang etiologi dan patogenesis MC25,26,27. Berdasarkan kajian kami sebelum ini, kami mendapati bahawa autoimun memainkan peranan penting dalam kejadian dan perkembangan MC12. Kajian ini mengkaji ekspresi kuantitatif IL-4, IL-17, dan IFN-γ, yang merupakan laluan pembezaan utama sel CD4+ selepas rangsangan antigen. Dalam kajian kami, berbanding dengan kumpulan negatif, kumpulan NPE mempunyai ekspresi IL-4, IL-17, dan IFN-γ yang lebih tinggi, dan tahap protein IL-4 dan IL-17 juga lebih tinggi.
Secara klinikal, ekspresi mRNA IL-17 meningkat dalam sel NP daripada pesakit yang mengalami herniasi cakera28. Peningkatan tahap ekspresi IL-4 dan IFN-γ juga ditemui dalam model herniasi cakera bukan mampatan akut berbanding dengan kawalan sihat29. IL-17 memainkan peranan penting dalam keradangan, kecederaan tisu dalam penyakit autoimun30 dan meningkatkan tindak balas imun terhadap IFN-γ31. Peningkatan kecederaan tisu yang dimediasi IL-17 telah dilaporkan dalam tikus MRL/lpr32 dan tikus yang mudah terdedah kepada autoimun33. IL-4 boleh menghalang ekspresi sitokin proinflamasi (seperti IL-1β dan TNFα) dan pengaktifan makrofaj34. Dilaporkan bahawa ekspresi mRNA IL-4 adalah berbeza dalam kumpulan NPE berbanding IL-17 dan IFN-γ pada masa yang sama; Ekspresi mRNA IFN-γ dalam kumpulan NPE adalah jauh lebih tinggi daripada kumpulan lain. Oleh itu, penghasilan IFN-γ mungkin merupakan pengantara tindak balas keradangan yang disebabkan oleh interkalasi NP. Kajian telah menunjukkan bahawa IFN-γ dihasilkan oleh pelbagai jenis sel, termasuk sel T penolong jenis 1 yang diaktifkan, sel pembunuh semula jadi dan makrofaj35,36, dan merupakan sitokin pro-radang utama yang menggalakkan tindak balas imun37.
Kajian ini menunjukkan bahawa tindak balas autoimun mungkin terlibat dalam kejadian dan perkembangan MC. Luoma et al. mendapati bahawa ciri-ciri isyarat MC dan NP yang menonjol adalah serupa pada MRI, dan kedua-duanya menunjukkan isyarat yang tinggi dalam urutan T2W38. Sesetengah sitokin telah disahkan berkait rapat dengan kejadian MC, seperti IL-139. Ma et al. mencadangkan bahawa penonjolan NP ke atas atau ke bawah mungkin mempunyai pengaruh yang besar terhadap kejadian dan perkembangan MC12. Bobechko40 dan Herzbein et al.41 melaporkan bahawa NP adalah tisu imunotoleran yang tidak boleh memasuki peredaran vaskular sejak lahir. Penonjolan NP memperkenalkan benda asing ke dalam bekalan darah, sekali gus menjadi perantara tindak balas autoimun tempatan42. Reaksi autoimun boleh mendorong sejumlah besar faktor imun, dan apabila faktor-faktor ini terdedah secara berterusan kepada tisu, ia boleh menyebabkan perubahan dalam isyarat43. Dalam kajian ini, ekspresi berlebihan IL-4, IL-17 dan IFN-γ adalah faktor imun yang tipikal, membuktikan lagi hubungan rapat antara NP dan MC44. Model haiwan ini meniru dengan baik terobosan NP dan kemasukan ke dalam plat hujung. Proses ini seterusnya mendedahkan kesan autoimun terhadap MC.
Seperti yang dijangkakan, model haiwan ini menyediakan platform yang mungkin untuk mengkaji MC. Walau bagaimanapun, model ini masih mempunyai beberapa batasan: pertama, semasa fasa pemerhatian haiwan, beberapa arnab peringkat pertengahan perlu dimatikan untuk ujian biologi histologi dan molekul, jadi sesetengah haiwan "tidak lagi digunakan" dari semasa ke semasa. Kedua, walaupun tiga titik masa ditetapkan dalam kajian ini, malangnya, kami hanya memodelkan satu jenis MC (perubahan jenis Modik I), jadi ia tidak mencukupi untuk mewakili proses perkembangan penyakit manusia, dan lebih banyak titik masa perlu ditetapkan untuk memerhatikan semua perubahan isyarat dengan lebih baik. Ketiga, perubahan dalam struktur tisu sememangnya boleh ditunjukkan dengan jelas melalui pewarnaan histologi, tetapi beberapa teknik khusus boleh mendedahkan perubahan mikrostruktur dalam model ini dengan lebih baik. Contohnya, mikroskopi cahaya terkutub telah digunakan untuk menganalisis pembentukan fibrokartilage dalam cakera intervertebral arnab45. Kesan jangka panjang NP pada MC dan plat hujung memerlukan kajian lanjut.
Lima puluh empat ekor arnab putih jantan New Zealand (berat kira-kira 2.5-3 kg, umur 3-3.5 bulan) telah dibahagikan secara rawak kepada kumpulan pembedahan palsu, kumpulan implantasi otot (kumpulan ME) dan kumpulan implantasi akar saraf (kumpulan NPE). Semua prosedur eksperimen telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Hospital Tianjin, dan kaedah eksperimen telah dijalankan mengikut garis panduan yang diluluskan.
Beberapa penambahbaikan telah dibuat pada teknik pembedahan S. Sobajima 46. Setiap arnab diletakkan dalam posisi baring lateral dan permukaan anterior lima cakera intervertebral lumbar (IVD) berturut-turut didedahkan menggunakan pendekatan retroperitoneal posterolateral. Setiap arnab diberi anestesia umum (20% uretana, 5 ml/kg melalui vena telinga). Hirisan kulit membujur dibuat dari tepi bawah tulang rusuk ke pinggir pelvis, 2 cm ventral ke otot paravertebral. Tulang belakang anterolateral kanan dari L1 hingga L6 didedahkan dengan pembedahan tajam dan tumpul pada tisu subkutaneus, tisu retroperitoneal, dan otot di atasnya (Rajah 6A). Aras cakera ditentukan menggunakan pinggir pelvis sebagai mercu tanda anatomi untuk aras cakera L5-L6. Gunakan jarum tusukan 16-tolok untuk menggerudi lubang berhampiran plat hujung vertebra L5 hingga kedalaman 3 mm (Rajah 6B). Gunakan picagari 5 ml untuk menyedut nukleus pulposus autologus dalam cakera intervertebral L1-L2 (Rajah 6C). Tanggalkan nukleus pulposus atau otot mengikut keperluan setiap kumpulan. Selepas lubang gerudi diperdalamkan, jahitan yang boleh diserap diletakkan pada fasia dalam, fasia superfisial dan kulit, dengan berhati-hati agar tidak merosakkan tisu periosteal badan vertebra semasa pembedahan.
(A) Cakera L5–L6 didedahkan melalui pendekatan retroperitoneal posterolateral. (B) Gunakan jarum 16-tolok untuk menggerudi lubang berhampiran plat hujung L5. (C) MF autologus dituai.
Anestesia am diberikan dengan 20% uretana (5 ml/kg) yang diberikan melalui vena telinga, dan radiografi tulang belakang lumbar diulang pada 12, 16, dan 20 minggu selepas pembedahan.
Arnab dikorbankan melalui suntikan intramuskular ketamin (25.0 mg/kg) dan intravena natrium pentobarbital (1.2 g/kg) pada 12, 16 dan 20 minggu selepas pembedahan. Seluruh tulang belakang telah dibuang untuk analisis histologi dan analisis sebenar telah dijalankan. Transkripsi terbalik kuantitatif (RT-qPCR) dan Western blotting telah digunakan untuk mengesan perubahan dalam faktor imun.
Pemeriksaan MRI telah dijalankan pada arnab menggunakan magnet klinikal 3.0 T (GE Medical Systems, Florence, SC) yang dilengkapi dengan penerima gegelung anggota ortogonal. Arnab dibius dengan 20% uretana (5 mL/kg) melalui vena telinga dan kemudian diletakkan terlentang di dalam magnet dengan kawasan lumbar berpusat pada gegelung permukaan bulat berdiameter 5 inci (GE Medical Systems). Imej penyetempatan berwajaran koronal T2 (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) telah diperoleh untuk menentukan lokasi cakera lumbar dari L3–L4 hingga L5–L6. Hirisan berwajaran satah sagital T2 telah diperoleh dengan tetapan berikut: jujukan gema putaran pantas dengan masa pengulangan (TR) 2200 ms dan masa gema (TE) 70 ms, matriks; medan visual 260 dan lapan rangsangan; Ketebalan pemotongan ialah 2 mm, jurang ialah 0.2 mm.
Selepas gambar terakhir diambil dan arnab terakhir dibunuh, cakera palsu, cakera yang terbenam otot, dan cakera NP telah dikeluarkan untuk pemeriksaan histologi. Tisu telah difiksasi dalam formalin penimbal neutral 10% selama 1 minggu, dinyahkalsifikasi dengan asid etilenadiaminatetraasetik, dan dipotong parafin. Blok tisu telah dibenamkan dalam parafin dan dipotong menjadi bahagian sagital (tebal 5 μm) menggunakan mikrotom. Bahagian-bahagian telah diwarnakan dengan hematoksilin dan eosin (H&E).
Selepas mengumpul cakera intervertebral daripada arnab dalam setiap kumpulan, jumlah RNA diekstrak menggunakan lajur UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) mengikut arahan pengilang dan sistem transkripsi terbalik ImProm II (Promega Inc., Madison, WI, USA). Transkripsi terbalik telah dilakukan.
RT-qPCR telah dijalankan menggunakan Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) dan SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) mengikut arahan pengilang. Isipadu tindak balas PCR ialah 20 μl dan mengandungi 1.5 μl cDNA cair dan 0.2 μM setiap primer. Primer telah direka bentuk oleh OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) dan dikeluarkan oleh Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (China) (Jadual 1). Keadaan kitaran terma berikut telah digunakan: langkah pengaktifan polimerase awal pada 94°C selama 2 minit, kemudian 40 kitaran 15 saat setiap satu pada 94°C untuk denaturasi templat, penyepuhlindapan selama 1 minit pada 60°C, pemanjangan dan pendarfluor. Pengukuran telah dijalankan selama 1 minit pada 72°C. Semua sampel telah dikuatkan sebanyak tiga kali dan nilai purata telah digunakan untuk analisis RT-qPCR. Data amplifikasi dianalisis menggunakan FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Ekspresi gen IL-4, IL-17, dan IFN-γ telah dinormalisasikan kepada kawalan endogen (ACTB). Tahap ekspresi relatif mRNA sasaran dikira menggunakan kaedah 2-ΔΔCT.
Jumlah protein diekstrak daripada tisu menggunakan homogenizer tisu dalam penimbal lisis RIPA (mengandungi koktel perencat protease dan fosfatase) dan kemudian disentrifugasi pada 13,000 rpm selama 20 minit pada suhu 4°C untuk membuang serpihan tisu. Lima puluh mikrogram protein dimuatkan setiap lorong, dipisahkan oleh 10% SDS-PAGE, dan kemudian dipindahkan ke membran PVDF. Penyekatan dilakukan dalam susu kering tanpa lemak 5% dalam larutan garam penimbal Tris (TBS) yang mengandungi 0.1% Tween 20 selama 1 jam pada suhu bilik. Membran diinkubasi dengan antibodi primer anti-dekorin arnab (dicairkan 1:200; Boster, Wuhan, China) (dicairkan 1:200; Bioss, Beijing, China) semalaman pada suhu 4°C dan bertindak balas pada hari kedua; dengan antibodi sekunder (imunoglobulin G anti-arnab kambing pada pencairan 1:40,000) digabungkan dengan peroksidase lobak (Boster, Wuhan, China) selama 1 jam pada suhu bilik. Isyarat Western blot dikesan melalui peningkatan kemiluminesen pada membran kemiluminesen selepas penyinaran sinar-X. Untuk analisis densitometrik, blot diimbas dan diukur menggunakan perisian BandScan dan hasilnya dinyatakan sebagai nisbah imunoreaktiviti gen sasaran kepada imunoreaktiviti tubulin.
Pengiraan statistik telah dijalankan menggunakan pakej perisian SPSS16.0 (SPSS, USA). Data yang dikumpul semasa kajian dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai (min ± SD) dan dianalisis menggunakan analisis varians ukuran berulang sehala (ANOVA) untuk menentukan perbezaan antara kedua-dua kumpulan. P < 0.05 dianggap signifikan secara statistik.
Oleh itu, pembentukan model haiwan MC dengan menanamkan NP autologus ke dalam badan vertebra dan melakukan pemerhatian makroanatomi, analisis MRI, penilaian histologi dan analisis biologi molekul boleh menjadi alat penting untuk menilai dan memahami mekanisme MC manusia dan membangunkan intervensi terapeutik baharu.
Cara memetik artikel ini: Han, C. et al. Model haiwan bagi perubahan Modic telah diwujudkan dengan menanamkan nukleus pulposus autologus ke dalam tulang subkondral tulang belakang lumbar. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., dan Boos, N. Pengimejan resonans magnetik tulang belakang lumbar: kelaziman herniasi dan pengekalan cakera, mampatan akar saraf, keabnormalan plat hujung, dan osteoartritis sendi faset dalam sukarelawan asimptomatik. kadar. Radiologi 209, 661–666, doi:10.1148/radiologi.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, dan Leboeuf-Eed, K. Perubahan Modik dan hubungannya dengan penemuan klinikal. Jurnal Tulang Belakang Eropah: penerbitan rasmi Persatuan Tulang Belakang Eropah, Persatuan Kecacatan Tulang Belakang Eropah dan Persatuan Eropah untuk Penyelidikan Tulang Belakang Serviks 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., dkk. Perubahan modik pada plat hujung vertebra lumbar: prevalens dan kaitan dengan sakit belakang bawah dan sciatica dalam kalangan pekerja lelaki pertengahan umur. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., dan Dalinka, M. MRI perubahan sumsum tulang berhampiran plat hujung dalam penyakit degeneratif tulang belakang lumbar. AJR. Jurnal Radiologi Amerika 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ, dan Carter, JR Penyakit cakera degeneratif: penilaian perubahan sumsum tulang belakang dengan MRI. Radiologi 166, 193–199, doi:10.1148/radiologi.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS, dan Carter, JR Pengimejan penyakit cakera degeneratif. Radiologi 168, 177–186, doi: 10.1148/radiologi.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, dkk. Peramal plat hujung neovertebral (Modic) memberi isyarat perubahan dalam populasi umum. Jurnal Tulang Belakang Eropah: Penerbitan Rasmi Persatuan Tulang Belakang Eropah, Persatuan Kecacatan Tulang Belakang Eropah dan Persatuan Eropah untuk Penyelidikan Tulang Belakang Serviks, Bahagian 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB dan Mannisch, K. Perubahan Modik selepas herniasi cakera lumbar. Jurnal Tulang Belakang Eropah: Penerbitan Rasmi Persatuan Tulang Belakang Eropah, Persatuan Kecacatan Tulang Belakang Eropah dan Persatuan Eropah untuk Penyelidikan Tulang Belakang Serviks 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., dan Kaapa, E. Perubahan jenis I yang modik boleh meramalkan degenerasi cakera ubah bentuk yang progresif dengan pantas: kajian prospektif selama 1 tahun. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ dan Fan, SW Perubahan modik: kemungkinan punca dan sumbangan kepada degenerasi cakera lumbar. Hipotesis Perubatan 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Pecah cakera dalaman. Masalah prolaps cakera lebih 50 tahun. Tulang belakang (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Masa siaran: 13 Dis-2024